Homologous ELISA procedure for the determination of penaeid shrimp vitellogenin

Un test ELISA homologue pour la détermination de la vitellogénine de crevettes pénéidés

¹ Present address: Universidad Autonoma de Nuevo León, Facultad de Ciencias Biologicas. Apartado Postal F-16, Ciudad Universitaria, San Nicolas de Las Garzas, N.L., C.P. 66450, Mexico
² IFREMER, Institut français de recherche pour l'exploitation de la mer, BP 70, 29280 Plouzané, France

Abstract

Vitellogenin (VTG) was isolated from the haemolymph of Penaeus vannamei by a three step procedure including ultracentrifugation, gel filtration and ion exchange chromatography. VTG was used to raise polyclonal antibodies that were purified by ion exchange chromatography. A two step competitive assay was developed in which VTG could be quantitated by its capacity to inhibit the binding of antibody to the VTG previously adsorbed onto a solid phase. Sensitivity from equilibrium and from non-equilibrium assays was 41 and 2.3 ng/ml respectively. Estimates of within-assay and between-assay variabilities of standard curves were 4.2 and 9.6% respectively. The inhibition curves for dilutions of haemolymph from vitellogenic females, egg yolk extracts and purified vitellin (VTL) were parallel to the standard VTG curve, haemolymph from immature females and males showed no cross-reactivity. The antibodies directed against VTG recognize but partially VTL as shown by displacement curves. Recovery tests were near 100%. Thus the procedure was considered to be suitable for the measurement of haemolymphatic VTG. The VTG enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) developed in this study was validated by detecting physiological VTG changes in female shrimps after being fed squid extracts.

Résumé

La vitellogénine (VTG) de Penaeus vannamei a été purifiée à partir d'hémolymphe par une procédure en trois étapes comprenant l'ultracentrifugation, la filtration sur gel et la chromatographie d'échange d'ions. Un essai compétitif en deux étapes a été développé par lequel la VTG peut être quantifiée en fonction de sa capacité d'inhiber la liaison de l'anticorps à la VTG préalablement adsorbée à une phase solide. La sensibilité pour des essais en équilibre et non-équilibre a été respectivement de 41 et de 2,3 ng/ml. Les coefficients de variation intra-essai et inter-essais ont été respectivement de 4,2 et 9,6 %. Les courbes d'inhibition pour des dilutions de l'hémolymphe de femelles en cours de vitellogenèse, d'homogénats d'ovaire de ces dernières et de vitelline (VTL) purifiée ont été parallèles à la courbe étalon de VTG; en revanche, l'hémolymphe de femelles sexuellement immatures et de mâles n'ont pas montrée de réactivité croisée. Les anticorps dirigés contre la VTG ne reconnaissent que partiellement la VTL comme l'ont montré les courbes de déplacement. Les épreuves de surcharge ont été approximativement de 100 %. Ainsi la procédure a été considérée comme adéquate pour mesurer la VTG hémolymphatique. Le test enzymatique immuno-adsorbant (ELISA) développé dans cette étude a été validé physiologiquement en détectant des variations de VTG chez des crevettes femelles nourries avec des extraits de calmar.