Cryopreservation of pre-hatch embryos of zebrafish (Brachydanio rerio)

La cryoconservation d'embryons avant éclosion de danio zébré, Brachydanio rerio

¹ The Research Centre, Luton College of Higher Education, Crawley Green Road, Luton, Bedfordshire, LU1 3LF, UK
² Asymptote, St John's Innovation Centre, Cowley Road, Cambridge, CB4 4WS, UK

Received: 24 November 1992
Accepted: 16 February 1993

Abstract

The toxicity of five cryoprotectants – methanol, DMSO, glycerol, ethanediol and sucrose – on different development stages of zebrafish embryos was investigated. Embryos were exposed to a range of cryoprotectant concentrations for 30 min at room temperature. Post-heart beat stage embryos were more resistant to cryoprotectants than carly embryonic stages. The maximum non-toxic concentrations of cryoprotectants on heart beat stage embryos were 2 M methanol, 2 M DMSO, 1 M glycerol, 2 M ethanediol and 0.5 M sucrose. Gradual stepwise addition did not reduce toxicity. Heart beat stage embryos survived 2 M methanol at room temperature for up to 5 hours, whilst DMSO and ethanediol were toxic after 3 and 1 hour exposure respectively. The effect of the nature and concentration of cryoprotectant, equilibrium time, and cooling rate were investigated during cooling to –30 °C. Methanol was more effective than either DMSO or ethanediol for zebrafish embryo cryopreservation and 0.3 °C/min was found to be the optimum cooling rate. Two-step addition of cryoprotectants, with the higher concentration of cryoprotectants added at 0 °C, improved the results. The best embryo survivals obtained after cooling were 94% at – 10 °C, 72% at – 15 °C, 43% at –20 °C, and 8% at –25 °C, no embryos hatched following cooling to –30 °C. Ice formation within the egg was found to be the main factor affecting survival of the embryos.

Résumé

La toxicité de cinq cryoprotecteurs a été étudiée, méthanol, DMSO, glycérol, éthanediol et sucrose, sur différents stades de développement d'embryons de Brachydanio rerio, avec une gamme de concentrations en cryoprotecteurs pendant 30 min et à la température de la pièce. Les embryons au stade postbattements cardiaques sont plus résistants aux cryoprotecteurs que les stades embryonnaires plus précoces. Les concentrations maximums non toxiques sur les embryons au stade « battements cardiaques » sont de 2 M pour l'éthanol, 2 M pour DMSO, 1 M pour le glycérol, 2 M pour l'éthanediol et 0,5 M pour le sucrose. La toxicité n'est pas réduite avec une addition graduelle progressive. Les embryons au stade « battements cardiaques » survivent avec 2 M de méthanol, à la température de la pièce, jusqu'à 5 heures, tandis que le DMSO et l'éthanediol sont toxiques après respectivement 3 et 1 h d'exposition. L'effet de la nature et de la concentration des cryoprotecteurs, au temps d'équilibre, et du taux de congélation ont été étudiés durant une congélation à –30 °C. Le méthanol est plus efficace que le DMSO et l'éthanediol pour la cryoconservation d'embryons de Brachydanio et le taux optimum de congélation a été de 0,3 °C/min. Une addition de cryoprotecteurs effectuée en 2 fois, avec la concentration la plus importante ajoutée à 0 °C, améliore les résultats. Les meilleurs taux de survie, obtenus après congélation, sont de 94 % à – 10 °C, 72 % à – 15 °C, 43 % à –20 °C et 8 % à –25 °C, aucun embryon n'a éclos lors de l'étape de congélation suivante à -30°C. Le principal facteur affectant la survie des embryons est la formation de glace dans les œufs.